10. Методические
трудности получения клонов НСК из ЭСК
В зародыше весь пул НСК нервной трубки образован
механизмом нейрональной индукции из эктодермы. Первые нестин+ НСК в нервной
трубке возникали у зародышей мыши 7,5 дня развития. Подобно эпибласту,
нервная трубка - это уникальная плюрипотентная ткань, где числом
формирующихся клонов НСК реализуется трехмерный проект мозга. На уровне
первичных клонов пролиферация определяется превалированием сигналов noggin,
SHH над BMP-4 и BMP-7 механизмом “дефолта”. Дефолт в развитии –это
автоматическая программа активации клеток после устранения ингибиторов (TGF-beta)
( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). Эти авторы наблюдали
частичную трансформацию ЭСК в НСК в редкой культуре без фидера и сыворотки.
Существенно, что ЭСК при этом переходе не подвергались предварительной
модификации в клетки первичной эктодермы. Присутствие фидерного мезенхимального
слоя сдвигало баланс сигналов в пользу других производных эктодермы
(эпидермис кожи). Факторы сыворотки также чаще всего блокировали нейрогенез
из ЭСК. Из отдельных клеток формировались клоны НСК с промежуточным
фенотипом между ЭСК и нейросферами, выделяемыми из концевого мозга
новорожденных животных. Единичные самообновляющиеся клоны НСК возникали при
плотности 20 ЭСК/мкл и 1000 ед LIF. Другие добавки (B27 supplement, EGF, bFGF)
без LIF не индуцировали образование клонов НСК. Этот путь получения нейросфер
нерентабелен из-за малой доли (0,2 - 0,4%) образующихся колоний НСК.
Показательно, что спектры мРНК исходных ЭСК и колоний НСК не претерпевали
существенных изменений, кроме исчезновения мРНК Oct4. В клонах сохранены мРНК
всех генов трех зародышевых листков и ранних master-genes рестрикционного
созревания клеточных линий. Плюрипотентность клонов НСК позволяла активно химеризовать
ткани зародыша-реципиента после имплантации в морулу. С этой целью были
получены нейросферы, стабильно меченые цветными белками. Пересаженные НСК
активно мигрировали, пролиферировали как в головном мозге, так и других
органах зародыша ( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). В
противоположность НСК зародыша, НСК из мозга взрослых животных, теряли
способность к химеризации зародышей ( Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz
J. Et al.,2000).
Судьба изолированных ЭСК зависела в основном от эпигеномных
синалов (noggin, notch, cerebrus, LIF, ВМР-4, ВМР-7). В культуре удалось
понять причину блокировки нейрогенеза при высоких плотностях ЭСК - мешают меклеточные
взаимодействия между слоями прогениторных клеток. Процент нестин+ клеток
снижался на 75-85% в плотных культурах эмбриоидных телец. Многие авторы
подтвердили, что в культуре ЭСК проще наладить получение нейронов, глии ( более
сложно получить олигодендроциты), чем превратить эмбриоидные тельца в нейросферы
( Okabe S., Forssberg-Nilsson K., Spiro A.C. et al., 1996; Brustle O., Jones
K.N, Learish R.D. et al.,1999; Finley M.F.A.,Devata S.,Huettner J.E.,1999).
Как известно, пересадки пролиферирующих тотипотентных ЭСК в мозг не
практикуются из-за риска малигнизации части клеток. Однако фракцию эмбриоидных
телец с дифференцирующимися нейронами удавалось пересаживать в мозг животных
без осложнений. После пересадки в мозг часть клеток трансформировалась в нестин+
популяции клеток ( Benniger Y., Marino S., Hardegger R. et al., 2000).
|