11. Получение
нейронов из ЭСК
Уже в начале 90-х годов в печати появились первые
протоколы наработки дифференцированных нейронов из ЭСК тератокарциномы (Yao
M.,Bain G., GottliebD.L.,1995). Сперва незрелые клетки тератокарциномы
размножали с помощью ростовых факторов в простой питательной среде с
добавками. Затем клетки переводили в среду без ростовых факторов, в которую
добавляли ретиноевую кислоту и В27 Neurobasal supplement. В новой среде
селективно выживали только постмитотические нейробласты, а незрелые
стволовые/прогениторные популяции погибали. В первых работах эффективность
образования нейронов in vitro оставалась ниже 10 %. Однако эффективность
лабораторного нейрогенеза можно значительно улучшить, если на первом этапе
улучшить образование НСК из ЭСК. Сперва необходимо увеличить выход нестин+
клеток в культуре . Затем изолированную популяцию НСК размножали в селективной
среде. Выход нейронов из высокоочишенной фракции НСК довели до 60-80%. В
конце 90-х годов фирма BioLayton (Калифорния) оказалась первым частным
собственником технологической линии с целью крупномасштабного выращивания
нейронов человека по всем стандартам GМP. Из стандартного сырья стали
готовить биотрансплантаты для лечения пациентов. Первоначально фирма купила
университетский патент Пенсильванского университета (авторы - Virginia Lee, John
Troyanovsky, No5792900), заявленный на способ изготовления нейротрансплантата
в виде однородной популяции нейронов, полученных из плюрипотентных незрелых
клеток эмбриональной тератокарциномы NT2N. Образование нейронов индуцировали
добавлением сыворотки и ретиноевой кислоты под контролем следующих маркеров:
нестин, NF-1, MAP-2C, alpha-internexin.Через 5-7 дней островки прикрепившихся
незрелых клеток начинали синтезировать N-кадхерин и NCAM. Еще через три дня
после добавления индукционной среды, состав которой запатентован, клетки
образовали нейрофиламенты, увеличивали фосфорилирование компонентов цитоскелета
и сигнальных белков. Еще через 10-13 дней культивирования 90-98% клеток
приобретали фенотип нейробластов с характерными отростками. Примерно 4-5 нед
уходило на созревание нейронов из ЭСК. Нейроны возникали не только из
одиночных прикрепленных клеток, но и агрегатов ЭСК. Синхронно с появлением
маркеров диффренцировки из клеток исчезал нестин. Более зрелые нейроны экспрессировали
белок tau и MAP-2b. Согласно GLP-протоколу, до 95% клеток в культуре превращались
в типичные нейроны с характерными отростками, электровозбудимой мембраной и
секрецией медиаторов. Остальные незрелые примесные клетки высортировывали на
поточном сортировщике клеток. Лабораторно полученные нейроны не ревертировали
спонтанно к фенотипу тератокарциномы или незрелых клеток, не давали опухолей
при введении в ткани животным. Лабораторно полученные нейроны фирмы BioLayton
хорошо выживали после трансплантации в мозге животных-реципиентов. Часть
клеток пролиферировала и встраивалась в локальные нейрональные сети (детали
см. www.biolayton.com). На языке профиля мРНК рестрикционное созревание тератокарциномы
NT-2 делилось на три этапа. (Przyborski S.A., Morton I.E., Wood A. et al.,
2000). В первую фазу увеличивалось число нестин+ клеток, что совпадало
с увеличением Notch-1 мРНК. Во вторую фазу роста мРНК NeuroD и снижения мРНК
нестина происходило накопление пула прогениторных клеток. Фазу постмитотических
зрелых нейронов верифицировали по накоплениею мРНК синаптофизина и энолазы и
одновременному исчезновению мРНК NeuroD.
Пути дифференцировки нейробластов из ЭСК тератокарциномы
прослеживали с помощью профиля экспрессии других генов. В случае дорзальных
(чувствительных) нейронов первой появлялась мРНК гена Рах-7 после добавления ретиноевой
кислоты. В случае вентральных нейронов первой детектировалась мРНК гена
Рах-6. Появление клеток нервного гребня в культуре маркировали появлением мРНК
генов Рах-7 и Erb3. Дальнейшее созревание сомато-мотонейронов маркировали
экспрессией Islet-1, Islet-2, Lim-3, HB-9. Краниальные мотонейроны экспрессировали
мРНК Islet-1, Islet-2, Phox-2b. Интернейроны экспрессировали мРНК Lim-1,
Lim-2, Eng-1 (Renoncourt Y., Carroll P., Filippi P. et al., 1998).
Ключевым моментом созревания ДОПА-нейронов из ЭСК линии NT2
была экспрессия гена тирозингидроксилазы (ТГ). В культуре максимальное
количество ТГ+ клеток удавалось получить с помощью трех индукторов : FGF-1,
стимулятора внутриклеточного уровня цАМФ ( форсколина) и активатора протеинкиназы
С ( форболового эфира –форбол-12-миристоил-13-ацетата). Эта «триада»
вызывала появление 10-20% ТГ+ нейробластов. Однако путем двухнедельной
инкубации в специальной среде для дифференцировки долю ТГ+ клеток удалось
поднять до 75% ( Iacovitti L., Stull N.D., Jin H.,2001). In situ, т.е. в
ходе эмбриогенеза ТГ+ нейробласты появлялись под влиянием других сигналов ( SHH
и FGF8) ( Stull N.D., Iakovitti L., 2001). Эти данные показали, что
лабораторные нейроны с выбранным профилем медиаторов реально получать
«неприродным» альтернативным путем, в обход путей и сигналов эмбриогенеза
мозга.
Другая стратегия наработки нейронов из линии ЭСК человека
намечена сотрудниками фирмы Герон ( Carpenter M.K., Inokuma M.S., Denham J. et
al.,2001). В суспензионной культуре ЭСК над фидером нарабатывают значительные
массы эмбриоидных телец. Далее начальную дифференцировку запускают
прикреплением агрегатов к подложке в среде с набором митогенов. Прикрепленные
массы начинают расти незрелой тканью, в которой экспрессируются ранние гены
нервной трубки. В ткани формируются клон-инициирующие клетки.
Новообразованные клоны маркировались нестином, виментином, GFAP, PC-NCAM.
Долю клонов НСК можно значительно увеличить путем подбора митогенов в
селективной среде. При пересадке выращенной незрелой ткани, напоминающей
нервную трубку, в мозг новорожденным мышам наблюдали интенсивную миграцию прогениторных
клеток в разные отделы мозга с последующей дифференцировкой внейроны, глию и олигодендроциты
( Carpenter M., Inokuma M.S., Denman J., 2001)
Ретиноевая кислота оказалась первым незаменимым
индуктором нейрогенинов или Neuro D на пути дифференцировки ЭСК в нейроны.
Однако нет четких однозначных прописей получения холинэргических, ГАМК- или серотонинэргических
нейронов на втором этапе дозревания бластных форм. Комбинации ростовых
факторов, нейротрофинов и других индукторов в дучшем случае заканчивались
смешанной дифференцировкой нейронов in vitro ( Takahashi J., Palmer T.D., Gage
F.H., 1999). Существенно также, что нейрогенез in vitro, запускаемый ретиноевой
кислотой, формировал нейроны из агрегатов, прикрепленных к поверхности
крупных распластанных клеток ( по фенотипу –это клетки первичной эктодермы ,
либо нейромезенхимы )( Bain G., Kitchens D, Uao M. et al., 1995).
|