ВНЕЗАПНАЯ СМЕРТЬ Материалы 2-го советско-американского симпозиума 1979 Индианаполис США

Под ред. А. М. Вихерта (СССР) и Б. Лауна (США)

(США)

ВВЕДЕНИЕ

Основой электрической активности миокарда является асимметричное распределение ионов относительно мембран, поэтому изменение взаимодействия миокардиальных мембран с ионами может в конечном итоге сыграть определенную роль в развитии внезапной смерти. В миокарде существуют две хорошо развитые мембранные системы, ответственные за поддержание высоких ионных градиентов. Это внешняя плазматическая мембрана — сарколемма и внутренняя система тубулярных мембран — саркоплазматический ретикулум. Хорошо установлено, что ионы кальция влияют на электрическую активность    миокарда и что и СЛ и СР принимают   участие в регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция в миокарде. Более того, показано, что катехоламины обладают действием как на СЛ, так и на СР [1], а также что ацетилхо-лин может изменять восприимчивость клеток миокарда к сигналам симпатических медиаторов [2].

Основная цель наших исследований состояла в изучении молекулярных основ действия катехоламинов и ацетилхолина на функции сердечных мембран. Основное внимание в этих исследованиях было уделено взаимодействию кальция с этими двумя мембранными системами. Нами были поставлены следующие задачи: 1) выделить и очистить СЛ и СР —две основные кальций-регулирующие мембраны; 2) идентифицировать и описать на молекулярном уровне свойства канала, ответственного за генерацию медленного входящего кальциевого тока; 3) установить на уровне миокардиальных мембран молекулярные основы функционального взаимодействия адренершческих и холинергических стимулов. В настоящем сообщении сделана также попытка дать краткий обзор экспериментальных достижений, способствующих решению первых двух из перечисленных задач.

МЕТОДЫ

Исследования фракций изолированных мембран проводили на неочищенных микросомальных фракциях миокарда собаки [3], а также на очищенных препаратах СЛ и СР в форме везикул [4]. Фосфорилирование мембранных белков в интактном сердце осуществляли с помощью метода, аналогичного недавно описанному Корр и Barany

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Хотя сердечные микросомы содержат смесь мембранных везикул, образованных из нескольких клеточных мембран, анализ маркёров показывает, что суммарное содержание вези» кул СЛ и СР составляет около 80—90% от общего количества везикул в смеси. Препарат грубых везикул был разделен на фракции в градиенте плотности сахарозы; относительное содержание энзиматических и неэнзиматических маркёров во фракциях СЛ и СР указывает на высокую степень очистки микросомальных везикул (рис. 1). Таким образом, было показано, что бета-адренергические рецепторные места, адренерги-ческие рецепторные места, аденилатциклаза и сиаловые кислоты мигрируют в градиенте плотности сахарозы вместе с маркерным ферментом сарколеммы—(Na+, К+)-АТФазой. С другой стороны, маркерный фермент СР (Са2+, К+)-АТФаза отчетливо отделяется от сарколемных маркёров.

В соответствии с многообразием функций СЛ и СР состав белков в этих очищенных мембранах оказался состоящим по крайней мере из 30 отдельных компонентов в каждой фракции. Электрофореграммы субфракций сердечных микросом СЛ и СР и исходной грубой фракции мембранных везикул в по-лиакриламидном геле представлены на рис. 2. Сравнение профилей окрашивания при использовании трех разных красителей (Кумасси синий, реактив Шиффа, «Стейнз-ол») показывает, что по крайней мере 5 основных белков, присутствующих в сарколемной фракции, принадлежат исключительно этой мембране. Точно так же по крайней мере 8 различных белков присущи только СР.

Существует множество подтверждений тому, что основные эффекты катехоламинов инициируются реакцией фосфорили-рования, стимулируемой циклическим аденозин-3',5'-моно-фосфатом (щАМФ) [1]. Для локализации мембранных белковых субстратов цАМФ-зависимой протеинкиназы мы использовали выделенные in vitro препараты сердечных СЛ и СР [6]. Очищенные СЛ и СР инкубировали с [7~32Р]-АТФ (адено-зинтрифосфат) как в отсутствие цаМФ, так и при его добавлении в среду. Для препаратов СЛ циклический АМФ стимулировал включение [32Р] по крайней мере в 6 белковых полос, молекулярная масса которых находится в диапазоне от 200 000 до 8000 (рис. 3). Скорее всего эти белки являются субстратами эндогенной цАМФ-зависимой протеинкиназной активности СЛ. Регуляторная единица протеинкиназы представлена темной линией с молекулярной массой приблизительно 55 000 (неопубликованные результаты). Можно предположить, что субстрат протеивкиназы с молекулярной массой около 10 000 или 8000 участвует в регуляции медленного входящего кальциевого тока [1, 6]. Как показано на правой панели рис. 3, белки GP также фосфорилируются в присутствии [у—32Р]-АТФ. Однако это включение [32Р] не стимулируется цАМФ. Как бы то ни было, цАМФ немного уменьшает общее включение радиоактивного фосфата, как это показано заштрихованными столбиками. Следовательно, можно сделать вывод, что СР не содержит эндогенной цАМФ-зависимой протеинкиназы. Однако в других работах [1] и нами [6] было показано, что СР содержит белковые субстраты для растворимой цитоплазмати-ческой пАМФ-зависимой протеинкиназы. Одним из них является фосфоламбан [6].

Уместно спросить, имеют ли эксперименты, проведенные на изолированных мембранах, какое-либо отношение к тому, что действительно происходит in vivo. Для решения этой задачи мы метили эндогенные пулы фосфита изолированных - перфузируемых сердец морских свинок с помощью радиоактивного неорганического фосфора ([32Р]). Было показано, что после установления равновесия метаболически активные сердечные клетки превратили фракцию [32Р] в [у—32Р]-АТФ [7]. Затем добавляли к перфузионному раствору изопротеренол (в концентрации 10~~7 М) и исследовали изменения сократимости, внутриклеточного уровня цАМФ и включения 32Р в сердечные микросомы. На рис. 4 показано увеличение сократимости (dl/dt) и соответствующее увеличение внутриклеточного уровня цАМФ. Ясно видно, что обе величины выросли, как и ожидалось при перфузии сердец изо-протеренолом.

После двух минут перфузии сердца быстро замораживали-в зажимах, и из этих сердец были приготовлены препараты мембранных везикул. Затем проводили гель-электрофорез и авторадиографию солюбилизированных мембран для оценки степени фосфорилирования мембранных белков в интактном функционирующем сердце. После адренергичеокой стимуляции изопротеренолом обнаружено увеличение удельного фосфорилирования по :кражней мер двух мембранных белков (рис. 5). Эти белки мигрируют с молекулярной массой около 20 000 и около 10 000 и могут соответствовать белкам аналогичной подвижности, которые фосфорилируются in vitro в очищенных мембранных препаратах.

Таким образом, можно предположить, что фосфорилиро-вание мембранных белков является конечным путем, по которому медиаторы вегетативной нервной системы изменяют электрические свойства сердца. Так как это фосфорилирование приводит к изменению метаболизма Са2+ под действием мем-браносвязанных белков, оно может вносить свой вклад в электрическую неустойчивость сарколеммы.

Это исследование было проведено отделением фармакологии и токсикологии, отделением медицины и Краннертовским институтом кардиологии Медицинской школы Университета штата Индиана, Индианаполис, штат Индиана. Оно было также поддержано субсидиями S01-RR-95371, HL-23704, HL-06308, HL-18795 и HL-07182 Национальных институтов здоровья, субсидиями Американской кардиологической ассоциации    (Индианский   филиал), Фондом Германа С. Краннерта.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.             Wollenberger A., Will H. Protein kinase-catalyzed membrane phospho-

rylation and its possible relationship to the role of calcium in the adre-nergic regulation of cardiac contraction.— Life. Sci., 1978, 22: 1159— 1178.

2.             Watanabe  A.   M.,     McConnaughey   M.     M.,    Strawbridge  R.  A.,    Fle-

ming J. W., Jones L. R., Bech H. R. Jr. Muscarinic cholinergic receptor modulation of beta-adrenergic receptor affinity for catecholami-nes.— J. Biol. Chem., 1978, 253 : 4833—4836.

3.             Besch H. R. J., Jones L. R.,  Watanabe A. M. Intact vesicles of canine

cardiac sarcolemma: Evidence from vectorial properties of Na+, K+-ATPase.— Circ. Res., 1976, 1976, 39 : 586—595.

4.             Jones L. R., Besch Ii. R. J., Fleming J. W., McConnaughey M. M., Wa-

tanabe A. M. Separation of vesicles of cardiac sarkolemma from vesicles of cardiac sarcoplasmic reticulum. Comparative biochemical analysis of component activities.— J. Biol. Chem., 1979, 254 : 530—539.

5.             Kopp S. J., Barany M. Phosphorylation of the 19 000-dalton light chain

of myosin in perfused ra heart under the influence of negative and positive inotropic agents.— J. Biol. Chem., 1979, 254: 12007—12012.

6.             Tada M-, Kircjberger M. A., Katz A. M. Phosphorylation of a 22 000-dal-

ton component of the cardiac sarcoplasmic reticulum by adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase.—J. Biol. Chem., 1975, 250: 2640-2647.